蘇州納米所裴仁軍研究團隊在G-四鏈體/hemin脫氧核酶結構設計和催化活性提升的研究上取得進展

  G-四鏈體是由一段或幾段G序列通過分子內或分子間Hoogsteen氫鍵連接成具有四股核苷酸鏈的DNA二級結構,特定的陽離子 (K+, Na+, NH4+) 位于結構中心進一步穩定結構。相對于雙鏈DNA來說, G-四鏈體結構具有離子依賴性而且根據富G序列的不同特點會呈現出不同的結構形態,因此爲許多生物有機小分子提供了不同的識別位點。這些小分子配體不僅可以識別特定構型的G-四鏈體,而且形成複合物結構後能顯示出非常特別的生物活性。其中引人注目的是,G-四鏈體與高鐵血紅素(hemin)形成的複合物顯示出非常好的過氧化物酶催化活性,因此被稱爲G-四鏈體/hemin 脫氧核酶G4/hemin DNAzyme,又叫 G-四鏈體过氧化物酶。目前,G-四鏈體过氧化物酶作爲一種人工酶或催化劑廣泛應用在,諸如生物分析,分子機器和DNA傳感器等多個領域。相較于傳統的催化酶,它具有低成本,易操作和高的穩定性等優勢,使得探究其催化的內在機理,進而提升催化活性的研究變得愈加重要。然而已有研究僅給出一些經驗式結論(如,hemin更傾向于與平行或混雜型的G-四鏈體結合hemin主要與平行G-四鏈體的3′末端的G-平面作用等)。 

  爲探究G-四鏈體过氧化物酶催化的內在機理和一般規律以及建立高效的催化體系,中科院蘇州納米所裴仁軍研究員課題組展開了系列工作。首先,項目團隊研究了d(G3TG3TG3TG3)序列(簡寫爲TTT,它主要形成分子內平行G-四鏈體)的不同位置处引入極性轉折位點,即設計了3′G5′-5′GGTG3TG3TG3-3′ (G55TTT), 3′G3TG35′-5′TG3TG3-3′ (TG55TT), 5′G3TG3TG3TGG3′-3′G5′ (TTTG33) 5′G3TG3T3′-3′G3TG3-5′ (TTG33T)四条序列,探究不同序列修饰對于結構形成和稳定性的影响。最终实验结果表明以上修饰不会改变结构的平行构型,然而不同極性轉折位點的引入對G-四鏈體結構稳定性和结构末端堆积具有重要影响:如当序列中末端一个G堿基發生轉置時,G-四鏈體結構的稳定性和分子间末端堆积相应增强,因此修飾後富G序列形成的G-四鏈體与卟啉分子(如NMMhemin)的相互作用增強,因此有利于提升G-四鏈體过氧化物酶的催化活性;相反,如果在序列的中间位置(靠近中间T堿基處)引入轉折位點,G-四鏈體結構的稳定性和分子间末端堆积相应減弱,因此不利于四鏈DNA結構與hemin的結合(圖1)。該工作近期發表在Wiley旗下雜志Chemistry-A European JournalChem. Eur. J., 2020, 26, 8631-8638)。 

      圖1. (A) G-四鏈體过氧化物酶在ABTS-H2O2體系下的催化流程圖;(B-C)上述序列與NMMhemin結合後熒光性能和催化活性對比 

  隨後,項目團隊選取較短的d(AGGGGA)序列爲初始研究對象,該序列主要形成四分子平行G-四鏈體,同時末端的A堿基作爲酸堿催化劑有利于進一步提升體系的催化活性。實驗中,首先對d(AGGGGA)序列中的G堿基的8號位點進行選擇性溴代修飾,這樣可以改變鳥嘌呤核苷的順反異構,有利于獲得不同構型的末端G-平面。最終設計了d(AGBrGBrGGA) F12, d(AGBrGGGBrA) F14)和 d(AGBrGGBrGA) F13)三條序列,它們形成的四鏈結構見2A-2D。圖2E-2F顯示,它們與卟啉分子NMMhemin結合後熒光性能和催化活性大小順序爲:AG4A F12 > F14 > F13同時hemin親和力測試實驗與上述結果保持一致,由此可以得出平行G-四鏈體催化活性大于反平行G-四鏈體主要是由于结构中含有3′-末端G-平面,且末端G-平面中反式的鳥嘌呤核苷更有利于與hemin結合發揮催化性能。 

      2. (A-D) AG4A, F12 , F14F13形成的四分子G-四鏈體(E-F) 四條序列與NMMhemin結合後熒光性能和催化活性對比 

  在此基礎上,項目團隊d(AGGGGA)序列進一步修飾——在序列的不同位置处引入極性轉折位點,設計了3'AG5'-5'GGGA3' (AGS55), 3'AGG5'-5'GGA3' (AG55), 5'A3'-3'GG5'-5'GG3'-3'A5' (A33G55), 3'A5'-5'GG3'-3'GG5'-5'A3' (A55G33)  5'AGG3'-3'GGA5' (AG33)五条序列,它們形成的四鏈結構見3對比后发现,它们的催化活性大小顺序为:AG55 > AGS55 > A33G55 > A55G33 > AG4A >> AG33(圖4結合hemin親和力實驗結果,可以得出增加3′-末端G-平面和3′ A堿基的个数均可以提升G-四鏈體过氧化物酶的催化活性。該研究成果近期發表在Royal Society of Chemistry旗下Chemical Science雜志上Chem. Sci., 2020, 11, 6896 - 6906)。 

      圖3. (A-E) AG55, AGS55, A33G55, A55G33AG33形成的四分子G-四鏈體 

      圖4. (A) AGS55AG55A33G55A55G33AG33pH 5 KCl的圆二谱圖;(B) 1.8 μM NMM分別滴定2.4 μM AGS55AG55A33G55A55G33AG33(C) AG4A, AGS55AG55A33G55A55G33AG33KClNaClpH 5)的V0值統計; (D) 不同序列V0值隨溶液pH的變化曲線 

  隨後,項目團隊還設計出了具有酸性依賴性的G-四鏈體过氧化物酶。目前報道大部分的G-四鏈體过氧化物酶都顯示在pH爲弱堿性的溶液條件下顯示較好的催化活性。而上述的實驗結果顯示,當G-四鏈體序列中含有多个末端A堿基時,在ABTS-H2O2体系下,弱酸性溶液中的催化活性较好。为了进一步设计出具有酸性依賴性的G-四鏈體过氧化物酶,項目團隊在d(AG4A)序列的3'末端引入-CCCCCCC (-C7)片段,即d(AG4AC7):該序列在特定的酸性溶液中可以組裝爲G-四鏈體+I-motif”交替連接的超分子DNA結構,而在中性或堿性溶液中則主要以單鏈或不完全互補的雙鏈形式存在。因此d(AG4AC7)當且僅當體系在弱酸條件下(pH 4.5-6.0)顯示出較強的催化活性;同樣原理,d(AGBrGGBrGAC7) (F13C7), 3'AG5'-5'GGGACCCCCCC3' (AGS55C7)兩條序列與hemin形成的複合物結構顯示出類似的特性;值得注意的是,3'AGG5'-5'GGACCCCCCC3' (AG55C7)序列,由于3'AGG5'-5'GGA3'片段形成的四分子G-四鏈體具有非常强的热稳定性(Tm > 95 ℃),因此AG55C7在酸性條件下組裝超分子結構,而在非酸性條件下以四分子G-四鏈體单体形式存在,使得该序列的催化活性受pH影响有限(圖5)。該工作近期發表在Royal Society of Chemistry旗下Chemical Communications雜志上Chem. Commun., 2020, DOI: 10.1039/D0CC03082A)。 

     圖5. (A) AG4AC7, F13C7, AGS55C7AG55C7形成DNA超分子结构的单体及其组装示意圖;(B) AG4AC7AGS55C7組裝結構的pH可控性;(C) AG4AC7, F13C7, AGS55C7AG55C7序列V0值隨溶液pH的變化曲線 

  課題組博士後曹豔偉爲以上成果第一作者,裴仁軍研究員爲通訊作者,相關工作得到了國家自然科學基金青年基金,江蘇省自然科學基金青年基金,中國博士後科學基金會特別資助以及中國博士後科學基金會面上項目的大力支持。 


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